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分析影響ELISA中非特異性顯色的原因

點擊次數:103   發布時間:2022/12/12 13:38:27

影響ELISA中非特異性顯色的原因很多,如試劑盒特異性、檢驗標本中含酶標記物的干擾物,操作過程中的問題。本文就這一原因作一簡要分析,以便可以通過以上措施把非特異顯色降至低限度,從而提高檢測的特異性,并得到更準確、可靠的實驗結果。
 
試劑盒特異性因素
1. 固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種,以微量滴定板為常見[1]。它具有良好的吸附性能,孔底透明度高,空白值低,各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,各產品的質量差異很大。因此,在選擇試劑盒同時要對其使用的微孔板型號進行認證,評估。
2.包被物的純度。在酶聯免疫測定尤其是間接ELISA中,試劑的特異性取決于使用抗原的純度。目由于技術條件的限制,包被用抗原或抗體的純度不可能達到100%,所以有些非特異性顯色不可避免,只能盡可能提高純度,提高特異性。目使用的包被抗原一般為合成多肽抗原。
3.包被抗體的效價。具有高親和力和高特異性的包被抗體,是決定試劑特異性的重要方面。
4 .封閉。是ELISA中重要的一步,目的是封閉固相載體表面尚未被所占據的空隙[2],減少后續步驟中非特異性蛋白的干擾。
 
檢驗標本中含有酶標記物的干擾物
1.內源性干擾物:類風濕因子(RF)、黃疸等,類風濕因子是可作用于多種動物以及人IgGFc段的自身抗體,多數為IgM類,能充當抗原成分與固相及酶標抗體反應,從而呈現非特異性顯色。
黃疸血標本中常含有內源性過氧化物酶,如用辣根過氧化物酶為標記物,就有可能產生非特異性顯色。
2 .外源性干擾物,常常因樣品采集、貯存、處理不當造成如樣品溶血,被細菌污染,標本凝集不全等。溶血標本,紅細胞溶解破裂,釋放出血紅素形成,而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物,以HRP為標記的ELISA測定中,溶血標本可能會增加非特異性顯色。如有細菌污染,菌體中可能含有內源性HRP(辣根過氧化酶)[2],有國內報道酶免HAg試劑檢測溶血標本時可造成假陽性[3]。如在冰箱中保存過久,其中的IgG可發生聚合,在間接法ELISA中可使本底加深[2]。因此,血標本在采集處理時應小心,在冰箱中保存不易過久。
標本凝集不全時,血清中會殘留部分纖維蛋白原,也易造成假陽性。
 
操作過程中的問題造成假陽性
1.加樣
對于間接ELISA標本一般都要進行稀釋,如果加樣不準就會造成誤差,尤其當稀釋倍數大時,很小的絕對誤差,會導致較大的相對誤差,使陰性(或弱陽性)標本呈陽性(或陰性)。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產生氣泡。目,大部分血站都已使用全自動酶免加樣系統處理標本,可較好地避免以上誤差。
2.洗滌
在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復結果的關健一步,應引起操作者重視。無論是手工操作還是機器操作,得出不正確的結果常與不正確的洗滌有關,ELISA就是靠洗滌來達到分離游離和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結合的物質,以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質。
3 .溫育
每種試劑都有其佳反應模式,其中溫度和溫育時間控制是重要因素。因孵育溫度高,反應時間長,會造成整板本底高,陽性率高。溫育一般用濕盒或水浴,反應板不宜疊放,以保證各板溫度都能迅速平衡,為避免蒸發,板上應加蓋。
4.酶標儀判讀
作為記錄測定結果的儀器,酶標儀的性能穩定與否,決定結果的可靠度。先酶標儀應定期進行保養,對濾光片要定期校正;其次酶標儀波長設置要正確,好使用雙波長,一個檢測波長,一個參比波長,以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外,在用酶標儀讀數時好先擦試微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標儀性能有所不同,使用中應詳細閱讀說明書

原創作者:上海恒遠生物技術發展有限公司

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